Qu'est-ce qu'une réaction en chaîne par polymérase (pcr)? faits sur test, étapes et utilisé pour

Qu'est-ce que la PCR (réaction en chaîne de la polymérase)?

La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est une technique utilisée pour amplifier des traces d’ADN (et dans certains cas, d’ARN) situées dans ou sur presque tout liquide ou surface où des brins d’ADN peuvent être déposés. La clé de la compréhension de la PCR consiste à savoir que chaque être humain, animal, plante, parasite, bactérie ou virus contient un matériel génétique tel que des séquences d’ADN (ou ARN) (séquences nucléotidiques ou morceaux d’ADN ou d’ARN) unique à leur espèce, et au membre individuel de cette espèce. Par conséquent, si un échantillon contient des segments d’ADN ou d’ARN, la PCR est une méthode utilisée pour amplifier (faire beaucoup plus de copies identiques) de ces séquences uniques, afin qu’elles puissent ensuite être utilisées pour déterminer avec une très grande probabilité l’identité de la source (une (personne, animal ou organisme pathogène spécifique) de l’ADN ou de l’ARN à l'état de traces trouvé dans ou sur presque n’importe quel échantillon de matériel.

L'amplification PCR n'est cependant qu'une partie du test d'identification. Une fois l'amplification effectuée (voir ci-dessous), les segments amplifiés doivent être comparés à d'autres segments de nucléotide provenant d'une source connue (par exemple, une personne, un animal ou un organisme pathogène spécifique). Cette comparaison de segments uniques est souvent effectuée en plaçant des séquences de nucléotides générées par PCR à côté de séquences de nucléotides connues provenant d'humains, d'agents pathogènes ou d'autres sources dans un gel de séparation. Le courant électrique traverse le gel et les différentes séquences de nucléotides forment des bandes qui ressemblent à une "échelle" en fonction de leur charge électrique et de leur taille moléculaire. C'est ce qu'on appelle l'électrophorèse sur gel. Les bandes ou "étapes" comme les étapes qui migrent aux mêmes niveaux dans le gel montrent l'identité des séquences nucléotidiques. Cette méthode est l’un des moyens les plus populaires de réaliser les tests PCR (voir figure 1).

Figure 1, bandes ou "échelles" comme des étapes de l'ADN de Mycobacterium produit par PCR (avec la permission du CDC)

Figure. Éléments répétitifs (Rep) –PCP (A) et électrophorèse sur gel en champ pulsé (PFGE) (B) d'isolats de Mycobacterium cosmeticum provenant de 2 patients de l'Ohio et d'un patient du Venezuela. La rep-PCR a été réalisée à l'aide de l'amorce BOXA1R (3) et la PFGE a été réalisée avec l'enzyme de restriction AseI. Voies 1 et 2, l'Ohio isole OH1 et OH2; pistes 3, 4, souches de contrôle ATCC BAA-878T et ATCC BAA-879; piste 5, isolat vénézuélien VZ1. Les standards de taille d’ADN sont les marqueurs 100 pb (S1) et 48, 5 kb (S2).

Comment se déroule la PCR (réaction en chaîne de la polymérase)?

En 1983, Kary Mullis a défini les étapes fondamentales pour amplifier les séquences d'ADN. Lui et Michael Smith ont reçu le prix Nobel pour avoir développé cette procédure en 1993. Il y a quelques étapes de base suivies dans l'ordre; La PCR peut être effectuée dans un seul tube avec des produits chimiques appropriés et un appareil de chauffage spécialement conçu. Les réactifs ou produits chimiques nécessaires sont les suivants:

• Un échantillon contenant une séquence nucléotidique (du sang, des cheveux, du pus, du grattage de la peau, etc.)
• Amorces d'ADN: ADN simple brin court qui se lie aux séquences nucléotidiques favorisant la synthèse d'un brin complémentaire de nucléotides
• ADN polymérase: enzyme qui, lorsque l’ADN est lié à une amorce, descend dans le segment d’ADN pour former des paires de bases complémentaires et synthétise ainsi un brin nucléotidique complémentaire de l’ADN (introduction d’une ADN polymérase résistante à la chaleur, Taq). polymérase, dérivée de bactéries résistantes à la chaleur, a nettement amélioré la capacité de réaliser une PCR)
• Un grand excès de blocs constitutifs de l'ADN appelés nucléotides (Adénine, Thymidine, Cytosine et Guanine, en abrégé: A, T, C et G, respectivement) est présent dans la solution. Lorsque ces blocs sont liés ensemble, ils forment une séquence nucléotidique ou un simple brin d'ADN. Lorsque ces blocs de construction se lient à leurs blocs de construction complémentaires par des liaisons hydrogène faibles (par exemple, A ne se liera qu'avec T et G qu'avec C), une séquence nucléotidique d'ADN complémentaire est formée et liée à l'ADN simple brin d'origine. Lorsque la liaison est terminée, un ADN double brin complémentaire est formé dans une séquence spécifique.

La PCR commence alors par un segment d'ADN d'un échantillon qui est placé dans un tube avec les réactifs énumérés ci-dessus. La solution est chauffée à au moins 94 ° C (201, 2 ° F); cette chaleur rompt les liaisons hydrogène qui permettent la formation de brins d'ADN complémentaires, de sorte qu'il ne subsiste que des brins simples dans le mélange (on parle de dénaturation de l'ADN double brin).

On laisse le mélange refroidir à environ 54 ° C (129, 2 ° F). À cette température, les amorces d’ADN et l’ADN polymérase se lient à un ADN simple brin individuel (on parle d’annelage de l’ADN). Comme les blocs constitutifs sont en excès (concentration élevée) dans le mélange, la polymérase les utilise pour créer de nouveaux brins complémentaires d’ADN (appelée extension de l’ADN) et ce processus est plus rapide à 72 ° C (161, 6 ° F). Ce processus crée une nouvelle molécule d'ADN double brin à partir de chacun des simples brins de la molécule d'origine.

Ce cycle est répété environ 40 fois dans une machine appelée thermocycleur qui répète automatiquement les cycles de chauffage-refroidissement, la quantité de chaque séquence d'ADN doublant chaque fois que le cycle de chauffage-refroidissement est terminé. Ce qui était à l’origine un seul segment court d’ADN peut être amplifié à environ 100 milliards de copies après 40 cycles de doublement.

Pourquoi un médecin demanderait-il un test de PCR (réaction en chaîne de la polymérase)?

Le test PCR constitue la base d'un certain nombre de tests pouvant répondre à de nombreuses questions médicales permettant aux médecins de diagnostiquer et de traiter les patients. Par exemple, les tests PCR permettent de détecter et d’identifier des organismes pathogènes chez les patients, en particulier ceux difficiles à cultiver (par exemple, le VIH et d’autres virus et certains champignons).

D'autres médecins ordonnent des tests de PCR pour aider à diagnostiquer des maladies génétiques, tandis que d'autres utilisent la PCR pour détecter des relations biologiques telles que l'identification des parents d'enfants. Les tests PCR sont également utilisés pour identifier et caractériser les mutations génétiques et les réarrangements trouvés dans certains cancers.

Cependant, les tests PCR ont été modifiés et étendus à de nombreux aspects des enquêtes scientifiques, notamment la biologie de l'évolution, les empreintes génétiques, les enquêtes médico-légales et bien d'autres.

Qu'est-ce que la RT-PCR?

La RT-PCR est un test PCR conçu pour détecter et mesurer l'ARN. Bien que les tests PCR initiaux aient amplifié l’ADN, de nombreux virus et autres composants biologiques (par exemple les mitochondries) utilisent l’ARN comme matériel génétique. La RT-PCR diffère de la PCR conventionnelle en prenant d'abord l'ARN et en convertissant le brin d'ARN en un brin d'ADN. Ceci est effectué essentiellement par le même procédé de PCR décrit ci-dessus à l'exception de l'utilisation d'une enzyme appelée transcriptase inverse au lieu de l'ADN polymérase. La transcriptase inverse permet de traduire un simple brin d'ARN en un brin complémentaire d'ADN. Une fois que cette réaction se produit, la méthode de routine PCR peut ensuite être utilisée pour amplifier l'ADN. La RT-PCR a été utilisée pour détecter et étudier de nombreux virus à ARN.

La RT-PCR ne doit pas être confondue avec une autre variante de la PCR, appelée PCR en temps réel. La PCR en temps réel est une variante de la PCR permettant d'analyser l'ADN amplifié au cours des 40 cycles habituels de la procédure. Bien que la procédure soit similaire à la PCR classique avec cyclage, la PCR en temps réel utilise des colorants fluorescents attachés à certains des blocs de construction ou à de petits brins de nucléotides. Selon la méthode utilisée, la fluorescence se produit lorsque les brins d'ADN amplifiés sont formés. La quantité de fluorescence peut être mesurée tout au long des 40 cycles et permet aux chercheurs de mesurer des produits spécifiques et leurs quantités au cours des cycles d'amplification. Cela permet souvent aux investigateurs ou aux techniciens de laboratoire de sauter l'électrophorèse sur gel ou d'autres procédures secondaires nécessaires à l'analyse des produits de PCR, produisant ainsi des résultats plus rapides.

La PCR en temps réel et la RT-PCR sont des variantes ou des modifications du test PCR initial. Cependant, il existe beaucoup plus de variantes (au moins 25) qui sont utilisées pour résoudre des problèmes spécifiques. Ils portent tous des noms différents, tels que PCR d'assemblage, PCR à démarrage à chaud, PCR multiplex, PCR en phase solide et bien d'autres.

La PCR va probablement continuer à être modifiée pour aider à répondre à toute autre question en médecine, en biologie. et d'autres domaines d'études.